Microscopie Multiphotonique
Mercredi, mars 25th, 2009L’étude des tissus biologiques et notamment des fonctions cellulaires est à l’heure actuelle rendue possible par l’évolution rapide des techniques de microscopie mais également par le développement d’outils chimiques adaptés permettant de sonder le vivant (sondes moléculaires, nanoparticules, …). La microscopie de fluorescence constitue en particulier un outil puissant pour l’imagerie du vivant. Elle présente toutefois un certain nombre de limitations (longueurs d’onde des sources lasers, toxicité de l’irradiation par les lasers lors de l’observation in vivo, pénétration limitée, autofluorescence des milieux biologiques, …).
La microscopie multiphotonique (ou non linéaire) dont l’apparition date du début des années 1990, pallie en grande partie ces problèmes. Le principe de la microscopie multiphotonique est d’utiliser comme mode de contraste un phénomène impliquant l’interaction simultanée de plusieurs photons (deux ou trois) avec l’atome, la molécule ou la structure à détecter. Un tel phénomène est possible si l’échantillon est excité par un champ laser suffisamment intense. La microscopie multiphotonique permet d’observer en 3D les tissus biologiques à quelques centaines de microns de profondeur.
La substitution d’une excitation de l’échantillon en régime continu par une excitation par un train d’impulsions permet d’appliquer une intensité lumineuse élevée (pendant les impulsions) tout en limitant l’énergie incidente sur l’échantillon. Dans un microscope, le phénomène non linéaire ne se produit de façon efficace qu’au voisinage du foyer de l’objectif où l’intensité est suffisante. La résolution axiale est ainsi liée uniquement au caractère non linéaire de l’excitation et ce ‘‘sectionnement optique’’ permet une résolution tridimensionnelle. Ce volume d’excitation est alors balayé en deux ou trois dimensions dans l’échantillon pour former une image.
Le succès de la microscopie à deux photons a entraîné depuis quelques années un regain d’intérêt pour des types différents de microscopies multiphotoniques, utilisant des phénomènes autres que la fluorescence comme source de contraste, et fournissant donc des informations différentes. C’est le cas, notamment, de la microscopie CARS (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering) et des microscopies GSH (Génération de Second Harmonique) et GTH (Génération de Troisième Harmonique)
Bien qu’encore relativement peu répandues, les microscopies GSH et GTH se combinent très bien avec la microscopie de fluorescence à deux photons pour l’observation de tissus intacts et fournissent des informations complémentaires. Ces techniques gagneront également à être associées avec des techniques d’imagerie spectroscopiques telles que la microscopie CARS.
Comme l’absorption à deux photons, CARS est un processus multiphotonique (il utilise deux photons pompes et un photon Stokes) qui est d’autant plus probable que les champs optiques sont forts. CARS requiert donc l’utilisation de lasers impulsionnels et, comme en fluorescence à deux photons, ne se produit qu’au foyer d’un l’objectif de microscope qui sert à focaliser les champs pompe et Stokes dans l’échantillon ; ce point de focalisation définit intrinsèquement un « volume de collection » qui permet d’obtenir par balayage des images tridimensionnelles.
Dans ces microscopies, le signal est produit uniquement au voisinage du point de focalisation, et dépend fortement de la distribution spatiale du champ focalisé (intensité, phase, polarisation).
Par ailleurs, en modulant spatialement le front d’onde à l’entrée de l’objectif au moyen d’un élément actif, il est possible de contrôler de façon dynamique la distribution du champ au voisinage du foyer. Cette possibilité ouvre de nombreuses perspectives en microscopie non linéaire.
